血友病A基因诊断研究进展

核心提示:

血友病A(hemophiliaA,HA)为最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病,其主要病因是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷而引起的FⅧ含量不足或功能缺陷,发病率约为1/5000男性,女性患者罕见。患者常出现自发性或外伤性出血不止,出血可发生在任何部位,但以关节出血最为多见,反复多次关节出血可导致患者致残,甚至危及生命。临床上根据患者血浆FⅧ促凝活性及症状严重程度将HA分为轻型、中型、重型,所占比例分别为40%、10%、50%。目前对本病尚无有效根治办法,因此开展携带者检出以及产前基因诊断是防止新患儿出生、阻断有害基因传递的有效措施。本文就HA基因诊断研究现状作一综述。

1FⅧ基因
FⅧ基因定位于xq28,1984年被克隆。基因长186kb,为一巨大基因,由26个外显子和25个内含子组成,FrilcDNA全长约9kb,编码长2351个氨基酸的FⅧ前体,后者在去除由19个氨基酸组成的信号肽及一系列加工修饰后可形成2332个氨基酸的成熟FⅧ蛋白。其中最大的外显子(第14号外显子)为3.1kb,最大的内含子(第22号内含子)为32kb。特别值得一提的是,内含子22中另有2个基因A和F8B。这是首次在哺乳动物发现的基因内基因。FⅧ基因转录起始点上游1kb到下游148bp范围内存在12个转录因子结合位点。此外,FⅧ基因内和上游还存在抑制子序列。目前尚未发现这些FⅧ顺式序列突变所导致的HA患者。

2FⅧ基因缺陷
FVm基因不仅结构庞大,而且突变种类繁多,存在着高度异质性,主要是基因点突变、缺失、插入和倒位等。

2.1倒位1993年,Lakich和Naylor等H:分别发现HA中的一半为重型,而重型HA中,约有40%~50%是由于F!I基因内含子22中的倒位突变所致。FⅧ基因内含子22中含有F8A和F8B两个基因,其中F8A转录方向与FⅧ相反,F8B转录方向与FⅧ相同,其编码产物功能仍不明了。F8A在FⅧ基因上游约400kb及500kb处存在2个同源拷贝(A2和A3),部分个体还存在3个拷贝。约半数的重型HA患者的F8A同其中一个拷贝发生染色体内同源重组,导致FⅧ基因断裂,发生内含子22倒位,FⅧ基因被分成方向相反的两部分,外显子1~22被移至上游,外显子23~26仍处于原位,分裂的两部分不能被剪接到一起,导致重型HA。其中84%发生在远端拷贝(A3),15%发生在近端拷贝(A2),另有1%发生在含有3个F8A基因同源拷贝的个体中j。这种独特的染色体内同源重组在其他人类疾病中没有先例。此外,FⅧ基因内含子1含有1kb的序列(intlb一1),其在FⅧ基因上游约140kb处,存在与其方向相反的同源序列(intlb一2),二序列间可能发生同源重组,从而导致FⅧ基因在内含子1处发生断裂和倒位。约有5%的重型HA患者发病机制与其有关。2.2点突变目前在FⅧ基因中已发现大量的点突变,分布于整个基因中。根据国际互联网HAM—STeRS站的最新统计数据(截止2007年3月),已报道的点突变有615种。其中错义突变462种,广泛分布于FⅧ基因的所有编码区,突变的效应与突变所累及的位置密切相关,主要导致轻、中型HA,少数引起重型HA;无义突变100种,基本上都导致重度表型;导致mRNA剪切异常的突变62种,累及已有的内含子GT剪接供位和AG受位,有些是由于突变引入了新的剪接位点。研究发现存在一些点突变的高发区~突变热点,其中之一为CpG岛,由于“C”容易甲基化而脱氨基形成“T”,因此是个突变热点。

2.3 缺失FⅧ基因的缺失可分为大片段缺失(>50bp)和小片段缺失(≤50bp)。目前已报道大片段缺失120种,缺失片段长度从不足1kb到大于210kb,即全基因缺失。多数大片段缺失的机制可能是非同源重组,大约5%的重度HA是由这种突变引起。FⅧ基因的大片段缺失几乎都引起重型HA。仅有少数几篇文章报道了大片段缺失能引起中型HA。小片段缺失已发现152种,比较平均地分布于各外显子,并且几乎都是导致重型HA。大多数小缺失都是导致框架移位(移码突变),从而影响FⅧ表达,但也有少数是非框架移位。

2.4 插入已发现的插入突变有57种,插入片段的长度由1bp至2.1kb不等,亦有插入3.8kb的LINE片段(一种分布于基因中的大约10个拷贝数的反转录序列),大多数插入片段长度仅1bp。所有的插入不论是否引起框架移位,都可引起重型HA。调查显示,内含子22倒位和错义突变是最主要的发病机制,分别占35.7%和38.2%,其次为小片段缺失侮人(10.2%)和无义突变(9.3%),而大片段缺失(3%),剪接位点有关的突变(2.6%)和内含子1倒位(0.9%)则较罕见。此外还有5.8%患者未找到任何突变位点|8]。对HA数据库HAMSTeRS进行分析后发现,重型HA中,42%为内含子22倒位,其余的有大片段缺失、无义突变、错义突变等。中型和轻型HA中,86%为错义突变,多数这些突变的发病机制尚不完全清楚。FⅧ基因近一半的点突变发生在CpG岛。

3 基因诊断
3.1直接基因诊断直接检测FⅧ基因突变不仅揭示HA的致病机制,还可用于携带者和产前诊断。首先是内含子22倒位的检测,以往国际上采用Southern印迹杂交法J。此法DNA用量大,步骤繁琐,周期长,使用放射性同位素。刘敬忠等报道了运用长距离PCR(1ongdistance-polymerasechainreac—tion,U).PCR)技术简便快速地检测出FⅧ基因内含子22倒位,并能检出携带者,进行产前诊断。Brinke等建立了检测内含子1倒位的双管多重PCR的方法。对于较大的缺失、插入(>50bp),以及影响限制性内切酶识别位点的突变,一般用South.ern印迹杂交方法检测。对于单个碱基置换,小缺失或插入,则需对FⅧ基因的所有编码区、侧翼内含子序列及5,端和3,端UTR进行全面分析,设计25对引物扩增除外显子l4的所有外显子及其侧翼内含子序列,14号外显子另设计8对引物分别扩增。随着PER的广泛应用,单链构象多态性分析(SS.CP)、异源双链分析(HA)、变形梯度凝胶电泳(cGGE)、化学错配切割(CMC)、寡核苷酸特异杂交等结合DNA测序已被广泛用于FⅧ基因突变的筛查。应用这些方法可检测出大多数HA患者的基因突变。
3.2 间接基因诊断
间接基因诊断检测的不是致病基因本身,而是通过紧密连锁的特别是基因内部的DNA多态位点的检测,跟踪致病基因的传递。作DNA多态分析,需要2个条件:①选杂合度高的位点,先证者母亲为杂合子,若为纯合子则无法跟踪;②必须要有家系为前提。目前在FⅧ基因内及其侧翼已发现至少11个可用于基因诊断的多态位点。除此之外,还有一些与FⅧ基因紧密连锁的基因外多态位点,如St14(DXS52)的可变数目串联重复(VNTR)等。在应用基因外多态位点进行连锁分析时,有可能因基因重组而产生误诊,所以,一般主张用基因内的多态位点作分析引。其中,基因内18号内含子的BclI,22号内含子的XbaI,19号内含子的HindⅢ,13号内含子的(CA)n,22号内含子的(GT)n(AG)n和基因外Stl4(DXS52)的VNTR的多态信息含量较高,是最有价值的多态性位点。选用这些多态位点,在有家系的前提下,可进行连锁分析。刘敬忠等对非倒位的HA家系采用BclIPCR/RFLP法进行连锁分析,有85%的机会可作出诊断。对于不能作出诊断者,采用基因内含子13(CA)n、内含子2(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性进行连锁分析(可诊断率为68%),而不首先采用St14Ⅵ、『TR/PCR(可诊断率为89.5%)。因为:①前2种方法基本上就可全部作出诊断了;②St14VNTR/PCR可诊断率虽高,但有5%重组率可能导致误诊。故只有当用前2种连锁分析法仍不能诊断者,才采用之。综上所述,各种方法都有其局限性,实际工作中往往需联合使用多种方法,才能对HA作出基因诊断。对重型HA患者应首选LD-PCR检查是否FⅧ基因倒位。对非倒位者,考虑到FVH基因大,突变位点多,采用间接连锁分析较为简便、易行,但要求被检家系有阳性家族史,至少有一个先证者,同时女性携带者的被检位点须为杂合子。若所有多态性位点均无法提供信息,则仍须借助于直接基因诊断。少数患者综合利用上述方法仍不能诊断,这些HA患者的基因突变有可能位于内含子、FⅧ基因的调控序列或其他位点中,其遗传缺陷有待于进一步研究,并建立相应的检测方法。

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